行业动态

在我们日常生活中，表面活性剂无处不在——从洗碗液、牙膏到化妆品、药品，甚至农业和环保领域，都离不开这种能够降低液体表面张力的物质。其中，鼠李糖脂作为一种典型的生物表面活性剂，因其优异的表面活性、生态友好性和生物降解性，已经广泛应用于个人护理、清洁剂、石油回收、农业、食品和药品等多个行业。

但鼠李糖脂的产业化之路始终面临着一个关键瓶颈：其天然主要生产者铜绿假单胞菌是一种条件致病菌，可能在产品中残留毒素，这严重限制了其在食品、医药和化妆品等安全敏感领域的应用，因此研究人员希望开发出更加安全的生产平台，恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）因其良好的安全性和代谢能力，成为了理想的替代宿主。

为了天然突破假单胞菌生产能力有限的瓶颈，近日，浙江工业大学生物技术与生物工程学院柳志强团队发表于 Journal of Agricultural and Food Chemistry的一篇题为“Hyperproduction of Rhamnolipid in P. putida by Protein and Metabolic Engineering”的研究中，研究人员通过蛋白质工程和代谢工程相结合改造传统假单胞菌，最终获得了大规模生产鼠李糖脂的工程化菌株 E3，在 5 L 生物反应器中实现了 28.6 g/L 的产量，实现了恶臭假单胞菌中通过代谢工程改造实现的最高产量。

首先，研究人员，采用了理性设计与计算机辅助设计相结合的策略，对鼠李糖脂合成过程中的关键限速酶 RHlA 进行了改造。

图 | 通过理性设计和计算机辅助设计筛选关键限速酶RhlA

利用分子动力学模拟技术，团队深入分析了 RhlA 与其底物的相互作用模式，通过模拟酶与底物在原子水平上的动态结合过程，成功识别出多个对催化功能至关重要的氨基酸残基。在获得这些关键结构信息的基础上，研究人员建立了计算机辅助筛选平台，通过模拟计算预测不同突变位点对酶催化性能的影响。

经过多轮筛选，研究人员最终确定了两个最具潜力的突变位点：F43W 和 G130N。其中，F43W 突变将苯丙氨酸替换为体积更大的色氨酸，这一改变不仅优化了底物结合口袋的空间构型，还通过增强疏水相互作用稳定了反应中间体。而 G130N 突变则将甘氨酸替换为具有极性侧链的天冬酰胺，这一变化在酶活性中心引入了新的氢键形成位点，显著改善了催化反应的环境。

进一步的分子动力学模拟验证显示，这两个突变协同作用，使 RhlA 与底物的结合自由能显著降低，结合稳定性明显增强。实验数据证实，经过改造的 F43W/G130N 双突变酶在实际发酵过程中表现优异，与野生型酶相比，鼠李糖脂的产量提升了约 35%，充分证明了该理性设计策略的有效性。

然而，仅仅优化关键酶的活性还不足以显著提升鼠李糖脂的生产能力，因此研究团队进一步进行了代谢工程改造。鼠李糖脂的合成需要两个关键的前体物质：dTDP-L-鼠李糖和 β-羟基脂肪酸。

其中，dTDP-L-鼠李糖的合成是限制鼠李糖脂生产的瓶颈之一。为了增加dTDP-L-鼠李糖的供给，研究团队引入了 rmlBDAC 操作子，这是来自铜绿假单胞菌的一个基因操作子，能够有效增强 dTDP-L-鼠李糖的合成，此外，通过过表达 rhlA 和 rhlB 基因，研究人员加强了鼠李糖脂合成途径中的关键酶活性。这些代谢工程的手段有效提高了假单胞菌对鼠李糖脂前体的利用效率，使得鼠李糖脂的产量再次提升了约 30%。

图 | 通过组合启动子工程与引入前体合成模块等代谢工程策略，进一步提了高工程菌的鼠李糖脂产量

除了酶工程和代谢工程的优化外，研究团队还通过改造发酵条件来进一步提升鼠李糖脂的生产效率。发酵过程中的碳源选择是影响产量的关键因素之一。为了平衡细胞生长与鼠李糖脂的合成，研究团队采用了葡萄糖和甘油的混合碳源进行发酵。这种混合碳源的使用不仅能有效支持细胞的生长，还能避免葡萄糖过快消耗导致的生产瓶颈。在此基础上，研究人员优化了发酵过程中的其他条件，如温度、pH值和搅拌速率，从而进一步提升了鼠李糖脂的生产效率。

图 | 工程化的假单胞菌 E3 菌株鼠李糖脂产量达到报道以来最高记录

通过这些工程化手段，最终研究团队成功获得了工程化的假单胞菌 E3 菌株，并在摇瓶发酵中实现了 5.1 g/L 的鼠李糖脂产量，而在 5 L 的生物反应器中，产量更是达到了 28.6 g/L，生产效率为 0.3 g/L/h，创下了假单胞菌通过代谢工程改造实现的最高产量。

总之，这项研究为我们展示了蛋白质工程和代谢工程相结合的巨大潜力。通过对关键酶的工程化改造、代谢途径的优化以及发酵条件的调整，研究团队成功实现了高效的鼠李糖脂生产，通过这一综合的工程化策略，研究团队也为未来其他生物合成产品的高效生产提供了宝贵的经验。

参考链接：

1.https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.5c06286