在全球范围内，减少糖的摄入已经成为健康共识。过量食用蔗糖与肥胖、糖尿病和心血管疾病紧密相关。为了替代蔗糖，市场上出现了各种人工合成的代糖，如阿斯巴甜和甜蜜素，但它们常常因安全性和口感问题而备受争议。相比之下，来自植物的天然甜味剂更受青睐，尤其是甜叶菊中的甜菊糖苷，因其天然来源、零热量和超高甜度，被认为是“下一代健康糖”。
在所有甜菊糖苷中，Reb M 被认为是最理想的成分。它的甜度约为蔗糖的 350 倍，口感接近蔗糖，没有常见甜菊糖苷的苦涩余味，因此被誉为“完美的天然甜味剂”。然而，Reb M 在甜叶菊叶片中的天然含量不到 0.1%，远不能满足工业化生产的需求。这一瓶颈长期限制了 Reb M 的推广。
近日，中国科学院大连化学物理研究所尹恒团队在 PNAS 发表的一篇题为“Characterization of SrUGT76G4 reveals a key residue for regioselectivity and efficient Reb M synthesis”的重要研究中，首次揭示了合成 Reb M 的关键酶 UGT76G4 的作用机制，并通过蛋白工程大幅提升了其催化性能，为高效合成 Reb M 打开了新局面。
甜菊糖苷的基本骨架来源于二萜化合物 steviol。不同位置上附着的葡萄糖基数量和排列方式，决定了它们的种类和口感。在甜叶菊叶片中，最常见的是 stevioside 和 Rebaudioside A，它们的甜度虽高，但带有苦味。相比之下，Reb M 因为在 C13 和 C19 两个位置都附着了葡萄糖基，甜味纯正而柔和，更接近人们熟悉的蔗糖风味，因此具有巨大的市场潜力。
图|甜菊糖苷的结构和合成途径，不同位置的糖基修饰决定了口感差异
但问题在于，Reb M 的合成需要多步糖基化反应，其中最关键的就是将 Reb D 转化为 Reb M 的最后一步，这一环节效率极低，成为产业化的最大障碍。
此前，人们已经知道酶 UGT76G1 可以参与这一路径，它能够催化 Reb E 转化为 Reb D，并进一步生成 Reb M。但 UGT76G1 存在一个致命缺陷：它更偏好在 C13 位置进行糖基化，而不是 Reb M 必需的 C19 位置，这大大限制了 Reb M 的生成量。
中科院团队的研究发现，另一个酶 UGT76G4 具有截然不同的特性。与 UGT76G1 相比，UGT76G4 更偏好在 C19 位置进行糖基化，其在 Reb D 转化为 Reb M 过程中的催化效率是 UGT76G1 的 12 倍。这意味着 UGT76G4 很可能就是推动 Reb M 合成的关键酶。
图| UGT76G1 与 UGT76G4 的对比，后者在 C19 位点催化效率显著提高
研究人员进一步利用晶体学和分子动力学模拟揭示了其中的分子机制。UGT76G4 与 UGT76G1 整体结构相似，但在 191–208 氨基酸区段存在细微差异。其中第 200 位残基起到决定性作用。在 UGT76G4 中，这个位置是甘氨酸，它体积较小，为底物在结合口袋中留出了更多空间，使 Reb D 能够以有利于 C19 糖基化的姿态结合。实验表明，如果将这一位点突变为亮氨酸（类似 UGT76G1），酶的选择性立即转向 C13，几乎丧失了合成 Reb M 的能力；而改为酪氨酸（G200Y）则不仅保持了 C19 的偏好，还显著提高了反应效率。由此可见，微小的残基差异，就足以改变整个代谢路径的走向。
在确认关键残基后，团队进一步开展了蛋白工程改造。他们先将 Gly200 改为酪氨酸（G200Y），稳定底物取向并提升效率；再将邻近的 Gln199 突变为异亮氨酸（Q199I），调整结合口袋的空间结构，使底物结合更紧密。两个突变结合后形成 Q199I/G200Y 双突变体，在 Reb E 转化实验中效率比野生型高出约 1.5 倍，Reb M 产率提升至 54%。
研究人员还在底物通道外引入 H155S 突变，优化氢键网络，改善底物进入反应中心的方式。最终形成的三突变体 H155S/Q199I/G200Y 性能最强，在 Reb D 转化为 Reb M 的反应中效率比 UGT76G1 高出 23 倍。在模拟工业化的分批补料发酵实验中，该突变体在 24 小时内即可将 90% 以上的 Reb D 转化为 Reb M，最终产物浓度超过 45 mM，创下目前报道的最高水平。
图|工程化突变体的转化效率和产率均得到了显著改善
总之，该研究通过蛋白工程将 UGT76G4 优化为高效生物催化剂，为未来在微生物或植物体系中大规模生产 Reb M 提供了工具，或将有望打破天然 Reb M 供给不足、成本过高的瓶颈，使这种新一代甜味剂真正走向食品饮料市场，满足消费者对“天然、健康、零卡糖”的需求。
参考文献：
1.Yu Wang et al, Characterization ofSrUGT76G4 reveals a key residue for regioselectivity and efficient Reb M synthesis, Proceedings of the National Academy of Sciences (2025). DOI: 10.1073/pnas.2504698122
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