行业动态

                 研究背景               

2′-岩藻糖基乳糖（2′-fucosyllactose，2′-FL）是母乳中最简单但含量最高的寡糖之一，对新生儿的健康发育有许多益处。然而，高成本的生产和有限的可用性限制了其在婴儿营养中的广泛应用以及对其潜在功能的进一步研究。因此，工业2'-FL的低成本生产越来越受到关注，并成为世界范围内专利保护竞争的焦点。

                 研究背景               

2020年，中科院研究团队使用突变型大肠杆菌C41（DE3）ΔZ，同时以甘油为碳源来进一步提高2′-FL的产量。对于2′-FL的微生物合成，需要三种成分，即供体底物GDP-L-岩藻糖、乳糖和α-1,2-岩藻糖基转移酶。因此，该研究通过对这三种成分的分析、改造，并优化发酵条件，从而提高2′-FL产量。

1.乳糖

考虑到宿主细胞中lacZ基因编码的活性β-半乳糖苷酶存在，将限制乳糖底物的利用，因此该研究采用了经lacZ基因突变工程处理的大肠杆菌C41（DE3）ΔZ，然后检测了其β-半乳糖糖苷酶活性。结果显示宿主菌株的确无法进行乳糖分解代谢，而将其全部用于2'-FL的合成。

2. GDP-L-岩藻糖

GDP-L-岩藻糖是岩藻糖基低聚糖生物合成反应中的重要底物。在该研究中，其在生产细胞中的可用性决定了2′-FL的总产量。为了增加GDP-L-岩藻糖供应以促进2′-FL的合成，研究团队使用CRISPR-Cas9编辑系统敲除了参与colanic酸合成的wacJ基因，创建了C41ΔZW菌株。结果表明，结果表明，通过失活竞争途径，2'-FL的产量显著增加，从乳糖中产生的2′-FL的产量提高到0.79 mol/mol，这意味着更多的GDP-L-岩藻糖可用于促进2′-FL的合成。GDP-D-甘露糖是参与GDP-L-岩藻糖从头途径生物合成的重要中间体，而nudD和nudk基因编码的水解酶会使其水解，因此删除单基因nudD和nudK以提高GDP-L-岩藻糖的浓度。此外，RcsA和RcsB都负责大肠杆菌中colanic酸合成的转录调控，在共表达RcsA和RcsB的菌株中，2′-FL浓度显著升高。

3. α-1,2-岩藻糖基转移酶

为了在2′-FL合成细胞中平衡更多的GDP-L-岩藻糖，将编码α-1,2-岩藻糖基转移酶基因futC的单个拷贝插入工程宿主的岩藻IK基因座，产生菌株C41ΔZWD-F。与对照菌株相比，滴度适度增加，表明额外的α-1,2-岩藻糖基转移酶活性有利地促进了更多乳糖的细胞内岩藻糖基化。

4. 探索适合发酵条件

为了充分发挥共表达manB、manC、gmd、wcaG、futC、rcsA和rcsB基因的工程菌株C41ΔZWD-F的生产性能，研究团队在500 mL带挡板摇瓶中优化了各种发酵条件，包括碳源、IPTG浓度和培养温度。首先，研究评估了等浓度葡萄糖代替甘油作为唯一碳源对2′-FL产生的影响 ，然而2′-FL的水平受到严重抑制，因此以甘油作碳源是目前已知的最适条件。其次，研究团队评估了不同浓度的IPTG（包括0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mM和0.5 mM）对2′-FL产生的影响，随着IPTG浓度从0.1 mM增加到0.5 mM，2′-FL的产生显著增加，在0.4 mM的IPTG下产生最高滴度6.32 g/L的2′-FL。此外，在0.3 mM的IPTG下，2′-FL滴度也高达6.26 g/L。考虑到IPTG的成本及其对生产细胞的不利影响，优选使用0.3 mM IPTG作为最佳诱导浓度。最后，研究人员还评估了不同的培养温度（包括25°C、26°C、28°C、30°C）在0.3 mM IPTG下对产量的影响。当温度升高到28°C时，2′-FL的产量达到了最高值，最高可达6.86 g/L，乳糖的产率约为0.92 mol/mol。综上所述，该研究获得了一个初步的最佳条件，即菌株C41ΔZWD-F/pRAB在以甘油为唯一碳源的摇瓶中，在0.3 mM IPTG和28°C下具有最佳的发酵性能。

该研究通过综合考虑细胞内乳糖利用率、GDP-L-岩藻糖可用性和岩藻糖基化活性，使用廉价的甘油作为碳原料，乳糖作为前体，高效生产2′-FL。最后，所得到的菌株C41ΔZWD-F/pRAB在50L补料分批发酵生物反应器中从乳糖中产生了66.80 g/L的2′-FL的最大滴度，产率为0.89 mol/mol，这几乎是分批发酵产生的9.74倍。此外，未来还需要考虑更多因素，如工程菌株的遗传稳定性，关键辅因子GTP和NADPH的再生，以及随后对发酵过程的彻底优化，以实现更经济甚至更好的2′-FL产量。

摘译：陈品洲

审核：张迪