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单萜吲哚生物碱（MIAs）是一类来自植物的复杂天然产物，具有广泛的医疗特性，可用于生产抗癌药物长春新碱和长春碱、血管扩张剂育亨宾以及抗疟药奎宁。其中，长春新碱和长春碱作为重要的微管抑制剂，需求最为迫切。然而，传统的从长春花中提取的方法产量低、成本高，难以满足不断增长的临床需求。

得益于酶鉴定技术和合成生物学工具的发展，近年来，已有超过 30 种来自植物的异源酶在酿酒酵母中表达，实现了长春碱前体的从头合成。

作为 MIA 的前体物质，荆芥醇的添加可以促进工程化细胞中 MIA 的生产。除此以外，该物质还有多种功能，例如，作为茶蚜的性信息素，用于有机茶叶种植中的害虫管理；作为生物活性化合物，能够刺激猫产生愉悦感并防御蚊子，可用于猫粮和猫玩具的添加剂。

荆芥醇的生物合成涉及从香叶基焦磷酸（GPP）经过香叶醇合酶（GES）、香叶醇 8- 羟化酶（G8H）、香叶醇氧化还原酶（GOR）、鸢尾素合酶（ISY）和类似乳液主要蛋白酶（MLPL）的五步反应。然而， GPP 池数量的不足、植物源性细胞色素 P450（CYP）酶 G8H 的表达不佳和催化活性有限，以及副产物形成造成的代谢通量流失，制约了其生产效率。

在酵母细胞器中，分隔生物合成途径是应对理化环境不理想、与细胞质间的代谢交叉和隔离毒性代谢物等问题的常见方法。研究表明，过氧化物酶体对细胞生长并非必须，且在大小和数量方面易于调节。通过将生物合成途径靶向到过氧化物酶体中，可以充分利用过氧化物酶体中的乙酰辅酶 A 并避免 GPP 的内源性竞争，从而提高目标产物的产量和酵母对产物的耐受性。

图 | 从头生物合成荆芥醇的代谢工程策略（来源：Metabolic Engineering）

毕赤酵母作为一种非传统酵母，因在植物天然产物的生物合成中展现出显著优势而被寄予厚望。近期，来自浙江大学的研究团队成功地建立了高效的毕赤酵母细胞工厂，用于香叶醇、8- 羟基香叶醇和荆芥醇的从头合成。通过关键限速酶过表达、CYPs 的蛋白质工程、ERG20 的动态调控、二倍体工程和过氧化物酶体区室化的策略，在 5L 生物反应器中使用补料分批发酵，滴度高达 4429.4 mg/L。

这项研究已经以“Metabolic engineering of Pichia pastoris for overproduction of cis-trans nepetalactol ”为标题发表在 Metabolic Engineering 上。该文章的通讯作者是生物质化工教育部重点实验室副主任，浙江大学化学工程与生物工程学院研究员连佳长博士，他的研究方向是基于合成生物学原理和基因组编辑技术的人工细胞工厂创建。

（来源：Metabolic Engineering）

在这项研究中，研究团队首先在毕赤酵母中建立起香叶醇的生产过程，为解决副产物形成和香叶醇的毒性问题，他们引入了融合酶 t43CrGES-ERG20ww 和带有增强型过氧化物酶体靶向信号类型 1（ePTS1）标记的 t43CrGES-ERG20ww，观察显示 GPP 和香叶醇能够穿过过氧化物酶体膜；为进一步提高产量，他们将两个额外的 t43CrGES-ERG20ww 编码基因和一个截短的 tHMGR 基因整合到以上菌株中，使得香叶醇滴度分别增加 2 倍和 3 倍。

随后，他们删除了 OYE2 和 OYE3 的变体以减少催化副产物形成，但香叶醇产量未提高，这表明可能存在其他未知内源性酶参与副产物合成。

此外，他们尝试在过氧化物酶体中重构整个 MVA 途径，发现这一过程这减少了对细胞质前体的需求并潜在地减少了过氧化物酶体的质量传递阻力，与细胞质菌株相比，过氧化物酶体菌株的香叶醇滴度增加倍数更高。

早前的研究证实，香叶醇向 8- 羟基香叶醇的转化由 CYP 酶 G8H 催化，这被认为是主要限速原因。而细胞色素 P450 还原酶（CPR）在 G8H 电子转移中起关键作用，因此，研究团队对 G8H 和 CPR 的组合进行优化，发现来自金银花的 LjG8H 与来自拟南芥的 tATR1 的组合对 8- 羟基香叶醇产量提高最为显著。

为减轻内质网负担，研究团队截断了 LjG8H 的不同区域，并整合到产香叶醇的菌株中。结果显示，t24LjG8H 与 CrCPR 的组合在细胞质中显著提高了 8- 羟基香叶醇产量，滴度达到 319.0 mg/L；且过氧化物酶体中的 t19LjG8H 与 CrCPR 组合也大幅提升产量，滴度增加了 57 倍以上。

图 | G8H 和 CPR 的蛋白质工程和亚细胞定位示意图（来源：上述论文）

随后，研究团队构建了生产荆芥醇的菌株。他们首先将 GOR、ISY 和 NcMLPL 基因整合到生产 8- 羟基香叶醇的菌株的基因组中。然而，由于 CrISY 的混杂性，产生了香茅醇等副产物。通过优化基因来源（使用 NmISY）和培养基（选择 YPD），荆芥醇的产量显著提高，副产物生成减少。

进一步的研究发现，在过氧化物酶体中只有不到 3.0% 的 8- 羟基香叶醇被转化为下游途径，他们推测这可能与辅因子供应和过氧化物酶体区室化对酶活性的影响有关。最终，他们采用两阶段发酵方法，通过在发酵液中添加 20%（v/v）的异辛烷（IPM）来促进毕赤酵母中荆芥醇的合成，有效减轻了荆芥醇的细胞毒性，并提高了产量。

为了避免与内源性甾醇生物合成的竞争，研究团队测试了四种不同类型的启动子以探索动态调控下毕赤酵母中 ERG20 的转录水平，然而 HXT1p、GUT1p 和 GUT2p、ERG1p 和 ERG7p 的替换并未如预期提高荆芥醇的产量。

相反，他们发现时间调节启动子 CDC1p 的杂交版本（CDC1pA 和 CDC1pC）能有效动态调控 ERG20 的表达，在 YPD 培养基中使顺反荆芥内酯产量比原始菌株 NEPC4 增加约 30%。此外，通过引入来自酿酒酵母的 ZWF1 和来自变形链球菌的 GAPN 来再生胞质 NADPH，结合 ERG20 的动态调控，他们成功将荆芥醇的滴度提高至 977.6 mg/L，比初始菌株提高了 21.8%。

后来，团队采用细胞质和过氧化物酶体的双重调节策略来优化荆芥醇的生物合成。首先，在过氧化物酶体中引入 MVA 途径和香叶醇生物合成途径的酶，发现这增加了产量，但存在产物转化效率低和细胞毒性大的问题。其次，通过将具有荆芥醇通路和过氧化物酶体香叶醇通路的单倍体菌株交配，构建了二倍体菌株 NEPC4/GERP12，进一步使产量达到 1124.4 mg/L。然而，高产量菌株的生长受到抑制，表明需要减轻产物积累带来的细胞毒性。

图 | NEPC6P3和二倍体菌株NEPC4/GERP12的构建示意图（来源：上述论文）

最后，他们在 5L 发酵罐中对性能最佳的二倍体菌株 NEPC4/GERP12 和胞质途径菌株 NEPC7 进行了补料分批发酵。NEPC4/GERP12 在 70 小时内达到固定期，滴度达到 3861.0 mg/L，但生长速度较慢。而 NEPC7 生长和积累荆芥醇较快，70 小时达到 4429.4 mg/L 的最高滴度。

图 | (A)NEPC4/GERP12的补料分批发酵曲线;(B)NPEC7的补料分批发酵曲线

（来源：上述论文）

综上所述，这项研究为开发毕赤酵母细胞工厂提供了宝贵的借鉴经验，并为 MIAs 的可持续高效生产提供了良好的解决方案。

参考资料：1.https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1096717624000806

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