行业动态

木质纤维素生物质是丰富、清洁的可再生资源，被视为可持续生产生物燃料和生物化学品的重要潜在原料。解脂耶氏酵母因其安全性和代谢可塑性成为新兴的合成生物学底盘菌，并能够以木质纤维素水解液为原料生产多种高附加值化学品。但是，木质纤维素水解液中两种主要抑制剂糠醛、乙酸的存在严重限制了解脂酵母对这一资源的利用，因此迫切需要提高解脂酵母对糠醛和乙酸的耐受性。由于微生物的代谢网络错综复杂，其对有毒物质的耐受性通常是多个生化过程综合调控的结果；而现有研究对与耐受相关的代谢过程了解不足，耐受性的提升也随之受到阻碍。

近期，天津大学团队在 Bioresource Technology 期刊在线发表了题为“Mining novel gene targets for improving tolerance to furfural and acetic acid in Yarrowia lipolytica using whole-genome CRISPRi library”的研究，报道了天津大学曹英秀课题组在全基因组水平识别解脂酵母耐受糠醛和乙酸新靶点，并解析关键靶点的耐受机理。天津大学化工学院博士后房立霞、博士陈雅如、硕士贺千禧为该论文的共同第一作者，曹英秀副教授为该论文的通讯作者，其致力于从全基因组水平系统地识别潜在耐受靶点，释放解脂酵母利用木质纤维素水解液的潜能。

图 | 在全基因组水平识别解脂酵母耐受糠醛和乙酸新靶点及机理解析

基于 CRISPR 的全基因组文库筛选已被用于在大肠杆菌、酿酒酵母等模式微生物中发掘新基因靶点并建立相应的基因型-表型关系。在解脂酵母 PO1f 中，以前的研究也已经建立了靶向其全基因组的 CRISPR-Cas9 文库，并成功用于识别高产脂质靶点。但是，CRISPR-Cas9 文库会造成靶向的基因功能丧失，从而不适用于研究必需基因，也无法产生多种基因调控水平。基于 CRISPR 干扰（CRISPRi）的文库允许不同程度的下调而不是完全破坏基因，从而确保靶点挖掘范围更大、灵活性更强。本文作者利用CRISPRi文库挖掘解脂酵母全基因组中与糠醛、乙酸耐受性相关的新基因靶点，实现对两种抑制剂耐受性的提高，并解析了关键靶点的耐受机理。

首先，作者在解脂酵母中建立了全基因组的 CRISPRi 文库，并成功筛选出 14 个与糠醛、乙酸耐受性相关的新基因靶点。通过将 dCas9 蛋白与以前研究结果中靶向解脂酵母 PO1f 全基因组的 sgRNA 相结合，作者首次在解脂酵母中建立了全基因组的 CRISPRi 文库。经过文库合成、转化、筛选等步骤（图 2a），对富集度（筛选后测序读数与筛选前测序读数的比值）最大的多个 sgRNA（以糠醛为抑制剂筛选时，在 2 种不同的数据处理方法中各选择富集度前 10 的 sgRNA；乙酸筛选同理）进行反馈验证，最终得到 7 个与糠醛耐受相关的基因靶点，相应的基因转录抑制工程菌可以在 3.6mM 的糠醛浓度下实现显著生长，基因敲除工程菌可以在 4.8mM 的糠醛浓度下显著生长（图 2b）；得到 7 个与乙酸耐受相关的基因靶点，相应的工程菌可以在 0.35% (v/v)的乙酸浓度下显著生长（图 2c），这是据我们所知解脂酵母能耐受的最高乙酸浓度。并且，没有以往的研究显示这 14 个基因与糠醛、乙酸耐受性有关，说明我们发现了耐受新靶点。

图2 | CRISPRi文库的建立与糠醛、乙酸耐受性基因靶点的识别

然后，作者将糠醛、乙酸耐受靶点进行组合转录抑制，以同时耐受两种抑制剂。工程菌F19-A19（转录抑制基因YALI1_A06958g和YALI1_F12842g）在 2.4mM 糠醛加 0.15% (v/v)乙酸的双重抑制剂中生长效果最好（图 3a）；而在没有抑制剂的条件下 F19-A19 与对照菌的生长状况几乎完全相同（图 3b），表明转录抑制靶点确实提升了工程菌对抑制剂的耐受性而不是无压力常态下的生长能力。
基因 YALI1_A06958g 的功能与 Rho 蛋白活性调节有关，作者推测其转录抑制促进了 Rho 蛋白进入活性状态并激活了下游的细胞分裂过程（图 3c），细胞在糠醛环境下的生长能力随之提高。蛋白组学和转录组学分析结果显示，在转录抑制基因 YALI1_A06958g 的工程菌 F19 中，参与  Rho 蛋白激活的 GEF 蛋白与对照菌相比表达上调了将近 150 倍，且 22 个与细胞分裂直接相关的基因的表达也得到显著上调（图 3d），符合对转录抑制 YALI1_A06958g 提升糠醛耐受性的机理的假设。

基因 YALI1_F12842g 编码一种丙酮酸激酶，作者推测其转录抑制可以产生更多的 3-磷酸甘油醛进入磷酸戊糖途径，从而产生更多的 NADPH 以清除乙酸造成的氧化损伤（图 3e），细胞对乙酸的耐受性随之提高。经过测量发现，转录抑制基因 YALI1_F12842g 的工程菌 A19 与对照菌相比， NADPH 水平更高而活性氧水平更低（图 3f），符合对转录抑制 YALI1_F12842g 提升乙酸耐受性的机理的假设。

图3 | 新靶点组合转录抑制提升对双重抑制剂的耐受性及相关机理分析

以上研究在以葡萄糖为唯一碳源的培养环境中进行，而木质纤维素水解液中另一种主要碳源木糖的利用同样值得关注。作者通过异源表达来自 S. stipitisd 菌的基因 SsXYL1 和 SsXYL2，以及过表达解脂酵母内源的基因YlXYL1 成功构建了解脂酵母木糖利用菌（图 4a）。在以木糖为唯一碳源的条件下对 14 个耐受靶点进行测试，发现转录抑制基因 YALI1_A07632g 的工程菌 F4-XYL 和转录抑制 YALI1_C20198g 的工程菌 A7-XYL 分别在3.6mM 的糠醛和 0.35% (v/v)的乙酸中仍能表现出良好的生长状况（图 4b）。

图4 | 以木糖为唯一碳源时提升对糠醛、乙酸的耐受性

最终在葡萄糖和木糖双碳源共利用的条件下，转录抑制基因 YALI1_A06958g 和 YALI1_F12842g 的工程菌 F19-A19X 实现了对 2.4 mM 糠醛加 0.2% (v/v) 乙酸的双重抑制剂的同时耐受（图 5）。

图5 | 葡萄糖和木糖双碳源共利用时提升对双重抑制剂的耐受性

综上，作者利用首次在解脂酵母中建立的全基因组 CRISPRi 文库，发现了7 个与糠醛耐受性相关和 7 个与乙酸耐受性相关的新基因靶点，最终实现了葡萄糖和木糖双碳源共利用条件下对 2.4mM 糠醛加 0.2% (v/v)乙酸的耐受。主要靶点转录抑制引起耐受的机理被推测为与促进细胞分裂和减少活性氧含量有关。本研究加深了对抑制剂和细胞代谢之间相互作用的理解，有助于解脂酵母对木质纤维素水解液的高效利用，从而推进了绿色生物制造。该研究获得国家重点研发计划（2021YFC2104400）和国家自然科学基金（NSFC 22078240）的资助。

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