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柚皮素（Naringenin）是一类重要的聚酮化合物，广泛存在于柑橘类水果和茄科植物中，已被证明具有多种生物活性。

柚皮素是整个植物黄酮类化合物合成过程中的关键中间体，其合成途径已被解析清楚。但是，目前酮类化合物的生产效率仍然比较低，大规模生产纯黄酮类化合物受到限制。

为了提高此类化合物的产量，格罗宁根大学的科学家们探索了使用丝状真菌鲁本斯青霉（Penicillium rubens ）作为生产类黄酮化合物底盘细胞的可能性。在研究中，该团队将编码柚皮素生物合成途径中酶的两个植物基因整合到次生代谢物缺陷的 P. rubens 4xKO 菌株的基因组中，并优化了发酵条件。结果显示，对从香豆酸中获得了较好的柚皮素摩尔产率，约为 88%，最高滴度为 0.88 mM（约为 239 mg/L）。

论文中指出，这项工作表明 P. rubens 是生产重组黄酮类化合物极具前景的底盘细胞，为进一步研究丝状真菌转化植物生物质提供了起点。

（来源：Journal of Agricultural and Food Chemistry）

该研究已发表在 Journal of Agricultural and Food Chemistry 上。本研究的共同第一作者是 Bo Peng，通讯作者是 Kristina Haslinger。Kristina Haslinger 是格罗宁格大学药物生物学助理教授，研究的重点是构建微生物细胞工厂，用于生产药用天然产品。

柚皮素是合成黄酮类化合物的通用中间体，业内已经探索了多种通过微生物底盘细胞生产黄酮类化合物的方法。此前的研究表明，基于微生物生产柚皮素的主要瓶颈是可用于宿主菌株次生代谢的游离丙二酰辅酶 A（丙二酰辅酶 A）的限制。因此，通过改造其上游途径和抑制微生物黄酮类化合物生产中的脂肪酸合成对增加丙二酰辅酶 A 库至关重要。

使用天然微生物作为底盘或者经过改造且可生产丙二酰辅酶A的底盘细胞对生产黄酮类化合物可能是一个更佳的方案。基于此，该团队专注于构建 P. rubens Wisconsin 54-125 的衍生物，选择了 P. rubens DS68530 的次生代谢物缺陷衍生物，并命名为 P. rubens 4xKO。该菌株通过利用 CRISPR/Cas9 删除原菌株四个高表达次级代谢物的基因簇构建。

（来源：上述论文）

首先，研究人员将编码 PhCHS 的基因以及编码 PhCHS 和 Pc4CL 的基因分别整合到 pen 基因座中，构建了两个菌株 P. rubens 4xKO-2F 和 P. rubens 4xKO-3F，并在实验室进行了初步发酵测试和优化。结果显示，P. rubens 4xKO-2F 培养物中的滴度极低，而共表达菌株 P. rubens 4xKO-3F 可能是生产柚皮素更好的策略，后者添加前体后 24 小时，该菌株生产柚皮素的最高滴度约为 0.05 mM。

在植物和细菌中，以对香豆酸为底物生产柚皮素涉及到查尔酮合成酶（CHS）和 4-香豆酸辅酶 A 连接酶（4-coumarate: CoA ligase，4CL）。来自 P.hybrida 的 PhCHS 和来自 P.criscum 的 Pc4CL 是一种高效的酶组合。

▲图 | P. rubens 4xKO 变体对柚皮素生产以及柚皮素标准品和样品的色谱分析的比较（来源：上述论文）

然后，研究团队探索了前体添加时间如何影响柚皮素生产。通过一系列试验，他们发现在 SMP 培养基中培养 24 小时后补加对香豆酸并在第二天收获培养物是最佳策略。

由于试验中柚皮素的最大滴度仍然非常低，接下来，研究团队决定进一步改善发酵条件。该团队先调整了培养基成分和 pH 值，试验结果显示，以葡萄糖为碳源的 SMP 培养基比乳糖培养基显著增加了柚皮素的滴度。随后在葡萄糖培养基中优化 pH 值， 并确定 pH 为 8.0 时滴度最佳。

在 pH 为 8.0、葡萄糖培养基条件下，对香豆酸生产柚皮素的滴度最高，约为 0.75 mM。因此，研究人员得出结论，在改变碳源和培养基的 pH 值条件下，在 36 小时内柚皮素滴度比此前提高了 1 个数量级（10 倍）。然而，从 36 小时到 48 小时期间，培养物中柚皮素的滴度逐渐下降。

▲图 | P. rubens 4xKO-3F 在不同培养基中积累柚皮素的过程（来源：上述论文）

之后，研究人员继续探索提高柚皮素的摩尔产率的方法，设计了另一个试验优化收获培养物的时间点并表征 P. rubens 4xKO-3F 菌株的生长表型。期间，生产柚皮素最高滴度和摩尔产率分别为 0.88 mM 和 88%。“这高于我们此前试验中的产率，表明 P. rubens 4xKO-3F 有潜力成为生产黄酮类化合物更具竞争力的微生物细胞工厂，P. rubens 可以用来生产大量柚皮素。”

该团队紧接着研究了添加较高浓度的对香豆酸前体是否会进一步增加柚皮素滴度。通过分析数据，研究人员发现，所有培养物在 36 小时测量到最高柚皮素滴度，1 mM 对香豆酸条件下达到最高摩尔产率。在 2.5 mM 条件下，检测到的柚皮素总体最高滴度为 1.5 mM。然而，随着前体含量越高，柚皮素滴度越低，分别为 1.32 mM 和 1 mM。
最后，该团队研究了异源表达的植物酶是否参与柚皮素降解，并研究了柚皮素降解的中间体。

参考资料：1.https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.3c06755

素材来源官方媒体/网络新闻

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