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尸胺（1,5-戊二胺）是一种天然的多胺类化合物，具备多种化学和生物活性，在农业领域可用于调节植物生长，在医药领域则可参与药物合成等过程。同时，它还是重要的 C5 平台化学品，是合成聚氨酯和生物聚酰胺（如尼龙）的关键单体。

近日，清华大学生命科学学院陈国强教授团队于 Journal of Agricultural and Food Chemistry 发表了一项题为“Engineered Vibrio natriegens with a Toxin−Antitoxin System for High-Productivity Biotransformation of L-Lysine to Cadaverine”的重要成果。该团队借助工程手段对需钠弧菌（Vibrio natriegens）进行改造，将 L-赖氨酸高效转化为尸胺，为工业生产尸胺提供了全新且有效的方法。 

尸胺可以通过工程化微生物从多种碳源从头合成，也可以通过工程化微生物的全细胞催化，从 L-赖氨酸一步合成。

在过往的研究中，大肠杆菌是生产尸胺的主要微生物底盘，然而由于大肠杆菌存在细胞膜通透性限制，使得底物和产物的转运效率较低。相比之下，需钠弧菌作为新一代工业生物技术的潜在底盘，具有着显著优势，其生长速度极快，能在短时间内达到较高的细胞密度。研究人员在对比需钠弧菌和大肠杆菌对 L-赖氨酸的耐受性实验中发现，当赖氨酸浓度达到 80 g/L 时，大肠杆菌会停止生长，而需钠弧菌的细胞密度仍能达到未添加赖氨酸时的一半以上，表明需钠弧菌对赖氨酸具有优异的耐受性，这些特性使需钠弧菌成为生物合成尸胺的理想候选菌株。

图 | 两种菌对赖氨酸耐受性差异及不同基因组合菌株的尸胺产量

野生型需钠弧菌无法从头合成尸胺，也无法将赖氨酸转化为尸胺。因此研究人员首先将尸胺的合成途径引入需钠弧菌，构建了多个携带不同基因组合的菌株。

其中两种赖氨酸脱羧酶——CadA 和 LdcC 是生产尸胺最有前景的候选酶，通常需要辅因子磷酸吡哆醛（PLP）；CadA 的一个突变体 CadAM3（V12C 和 D41C 突变）表现出更好的 pH 稳定性；CadB 是一种赖氨酸-尸胺反向转运蛋白，在尸胺分泌和赖氨酸摄取中发挥双重作用；LysP 是一种赖氨酸特异性渗透酶，有助于赖氨酸的摄取。

结果显示，过表达 CadAM3 的需钠弧菌并未比过表达原始 CadA 的菌株产生更高的尸胺滴度。在一系列过表达 CadA 的菌株中，额外过表达编码 CadB、LysP 或两者的基因显著提高了尸胺的产量。最终携带 pSEVA341-pTac-ldcC 的需钠弧菌被用于后续的深入研究，并探究最佳反应条件为：在 0 小时初始添加 2 mg/L 的 IPTG，随后在第 8 小时添加 60 g/L 的赖氨酸和 0.05 mM 的 PLP，维持培养环境在 pH 7 和 37°C。在 8 小时的催化过程中，其生成了 31.9 g/L 的尸胺，转化率为 76.1%。

尸胺的分泌和赖氨酸的摄取在尸胺生物催化中发挥重要作用。研究中采用了两种策略来优化尸胺和赖氨酸的转化。

第一种，研究人员致力于提高细胞膜通透性，以优化赖氨酸和尸胺的转运效率。他们研究了多种表面活性剂（如 SDS、Triton X-100、Tween 20）和有机溶剂（甲醇、乙醇）的作用，结果发现 0.2 mM 的 SDS 提升尸胺产量的效果最为显著。

第二种策略与 LysE 有关，敲除 lysE 可以减少胞外赖氨酸的运输，促进胞内赖氨酸的积累。其中 V. natriegens ΔPN96_RS17440 菌株的效果最为明显，尸胺产量得到了明显提升。

在上述优化条件下，携带 pSEVA341-pTac-ldcC 的 V. natriegens ΔPN96_RS17440 在 0.2 mM SDS 存在下积累的尸胺滴度最高，达到 37.7 g/L，转化率为 90.1%

图 | 尸胺产量优化策略

为进一步提高尸胺的生产效率并降低成本，研究人员还将源自嗜盐菌（Halomonas bluephagenesis）的 hbpB/hbpC 毒素-抗毒素（TA）系统引入需钠弧菌。

以 sfgfp（超折叠绿色荧光蛋白）为报告基因的实验显示，该系统显著提高了质粒稳定性，增强了蛋白质表达，增加了细胞密度。并且，由于无需使用抗生素，生产成本得以降低。

图 | 利用 sfgfp 作为报告基因对带有毒素-抗毒素系统的质粒进行表征

利用携带毒素-抗毒素系统的 V. natriegens 进行尸胺的全细胞催化。在 7 L 生物反应器实验中，携带 hbpBC TA 系统的菌株表现优异。例如，V. natriegens ΔPN96_RS1744 菌株，携带 pSEVA341-pTac-ldcC-pHbpBC-hbpBC，尸胺产量达到 158 g/L，生产率为 14.4 g/L/h，相比原始菌株产量提高了 37%，且所有菌株的转化率均保持在 90% 左右。 

总之，通过基因编辑和导入毒素-抗毒素系统等手段，研究团队成功工程改造了需钠弧菌，使其成为高效生产尸胺的优质底盘，并展示了需钠弧菌在尸胺的生物制造上的巨大潜力。

参考文献：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.4c12616

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